本帖最后由 橙色雨丝 于 2017-11-13 12:01 编辑
最近，在短短的两个月内，FDA先后批准了两个CAR-T产品上市，像是给本来已经热得发烫的CAR-T产业又注射了两剂强心针。那么，这个让无数病友心动、无数药企眼馋的CAR-T到底是个什么东西，它是怎么来的，将来又会到哪里去？
在这里，我们试图通过这篇文章，讲清楚CAR-T的来龙去脉，让淋巴瘤病友们对CAR-T有一个全面和清醒的认识。我们将会提到与CAR-T密切相关的四位先驱人物，三家领先企业，两个关键专利，和一个重要问题，相信大家在搞清楚这1，2，3，4之后，对CAR-T的了解会比一般的血液科医生都要全面（我这么说会不会有医生来打我？）
在开始之前，先慎重的提醒所有有意参加CAR-T试验的淋巴瘤病友们，目前这个技术还处于发展阶段，很多方面还不成熟，实施过程中也蕴含着极大的风险，如果不是到了走投无路的地步，还是不要轻易去尝试这个东西为好。
图一：再抢救一下？
一、终极大法
多年以来，人类一直在苦苦探求攻克癌症的“终极大法”，从手术到放疗再到化疗，再到免疫疗法，我们已经走过了很远的路，取得了很大的成就，但是仍然还没有找到能够彻底攻克癌症的“终极大法”。很多人为此付出了毕生的精力，我要说的第一位先驱人物，就是美国国家癌症研究院（National Cancer Institute，以下简称NCI）外科主任Steven A. Rosenberg，也许很多人都没有听说过这个名字，但是如果我告诉你，当初里根总统患结肠癌的时候，就是这位老兄给动刀切的，这下你该记住了吧？
图二：NCI外科主任Steven A. Rosenberg
作为一名NCI的外科医生，他对手术以及放化疗在肿瘤治疗上的局限性有着深刻的体会。比如说，转移性恶性黑色素细胞瘤，手术不能彻底解决问题，而对放化疗又不敏感，简直一点办法也没有。可以尝试用大剂量白介素2来治疗，但是有效率充其量不过15%，而且多数情况下效果不可持续。Rosenberg就开始动脑筋了：肿瘤细胞附近总是能发现一些淋巴细胞，这些细胞被称为Tumor Infiltrating Lymphocytes（肿瘤侵润淋巴细胞，以下简称TIL），从类型来看这些细胞多为T细胞，都说T细胞能够特异性的识别肿瘤细胞抗原，因此是人体抵抗肿瘤的主要武器，那么，能不能利用一下这些T细胞呢？于是，Rosenberg将恶黑患者肿瘤处的TIL提取出来，和肿瘤细胞一起做了基因测序，发现确实有一部分T细胞是由于识别出了肿瘤细胞特异性的抗原因此特意跑到肿瘤发生的部位来进行围剿的，之所以围剿不成功主要是因为这种细胞的数量太少，战斗力太弱。接下去Rosenberg就做了两件事，第一是将分离出来的这部分T细胞进行体外扩增，极大的增加其数量，然后再回输到患者体内，第二是在回输完成后分次给患者注射大剂量白介素2。白介素2在这里起什么作用呢？这是因为TIL属于已经被激活的效应性T细胞，T细胞被激活后原先位于细胞表面的低亲和性的白介素2受体（IL-2R）会变成高亲和性受体，这个受体与白介素2结合后会使效应性T细胞的杀伤力增大，增殖能力也变得更强。试验的结果是，这种治疗方法的有效率达到了40%，比以前有了很大的进步。后来，这种疗法被称为过继性细胞免疫疗法（Adoptive Cellular Immunotherapy），过继性的意思指的是先把细胞从人体内提取出来进行培养，然后再进行回输。之后发展起来的LAK细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞以及CAR-T细胞疗法都属于过继性细胞免疫疗法的范畴，而早年间Rosenberg这个名字简直就是过继性细胞免疫疗法的代名词，因此，我们把他称为是CAR-T疗法的前驱之一，不算过分吧？
但是，在他研究过继性细胞免疫疗法的年代，基因测序、体外培养都是既费时又费力还费钱的事情，几乎无法在临床上推广，只能在实验室里做研究，所以，临床上不能说是很成功。另外，从TIL着手，本质上讲是一种被动的手段，因为他研究的恶黑恰好是一种免疫原性很高的肿瘤（免疫原性指的是抗原刺激机体产生免疫应答的能力），所以他取得了一定的成果，可如果是免疫原性很差的肿瘤，T细胞根本就识别不出肿瘤细胞因而不能做出免疫应答怎么办？
正当Rosenberg这位美裔犹太人苦苦思索这个问题的时候，他的以色列犹太老乡却提前找到了答案，这就是我们所要提到的第二位先驱人物，即以色列魏茨曼科学研究院（Weizmann Institute of Science）的科学家Zelig Eshhar。我不想在这里搞种族主义，但是不得不说犹太人确实是地球上最聪明的种族之一，一旦他们脑洞大开，整个世界都会颤抖，历史都会被改写，如果不服请问问卡尔.马克思，再问问阿尔伯特.爱因斯坦！ 图三：以色列科学家Zelig Eshhar
Eshhar和他的同事想到的办法是：与其说被动的等待DC细胞（树突状细胞）找到肿瘤抗原，将其加工处理后再递呈给T细胞让其识别，我们为什么不主动的给T细胞装上一个能够识别肿瘤细胞特异性抗原的受体呢？恰好，对逆转录病毒的研究使得这种想法具有可操作性，因为逆转录病毒这种生物界的奇葩（严格地说病毒甚至不能算是生物）能够逆天而行用RNA指导DNA的合成，因此是一个合适的基因导入的载体，我们可以用它把想要表达的基因插入任何一个细胞的染色体当中。
不过，最初Eshhar的兴趣只是在研究MHC限制性上，T细胞受体（TCR）在识别靶细胞例如肿瘤细胞时，不仅要能够识别抗原肽，还要识别与抗原肽结合MHC的分子，也就是说必须能够识别抗原肽-MHC复合体，这就叫做Ｔ细胞的MHC限制性，但是肿瘤细胞为了逃脱免疫监视往往会调低甚至丢失MHC的表达，这样Ｔ细胞就无法识别了，从而失去了作用。 图四：T细胞MHC限制性
为了绕开MHC限制性这个恼人的障碍，Eshhar想出了一个解决办法，首先是找到一个合适的TAA（Tumor Associated Antigen，即肿瘤相关抗原），然后给Ｔ细胞装上一个与这个抗原相对应的scFv（single chain Variable fragment，即单链抗体），严格的说只是抗体的一个片段，这样就没有MHC分子什么事情了，抗原遇到抗体，就像干柴遇到烈火，两者立刻就开始啪啪啪，于是Ｔ细胞成了装有制导系统的导弹，想想就觉得很美妙呢，一开始Eshhar将这种经过基因修饰的Ｔ细胞叫做Ｔ-bodies，这就是CAR-Ｔ的雏形。 图五：第一代CAR-T
但是，现实却不是想象的那样美妙，Eshhar的试验多数时候都不大成功，首先是很难找到合适的肿瘤相关抗原，其次，因为缺乏共刺激信号，Ｔ细胞往往会未老先衰，起不到抗肿瘤的作用。关于共刺激信号，原理大致如下：Ｔ细胞从胸腺分化成熟然后进入外周血时，属于naive T cell，即初始Ｔ细胞，就好比至尊宝还没有遇到给他脚底板三颗痣的紫霞，无法变成孙悟空，即成为效应性Ｔ细胞，具备杀灭肿瘤细胞的能力。要激活Ｔ细胞，需要两个条件，第一是通过TCR的通路给细胞核传送第一个刺激信号，这是经过TCR对抗原肽-MHC复合体的识别实现的，由CD3的zeta链具体实施，第二个条件是经由CD28-B7通路提供第二个刺激信号，即Ｔ细胞表面的CD28与树突状细胞或靶细胞表面的B7结合从而产生一个共刺激信号。造物主这样的设计也是出于无奈，因为Ｔ细胞杀伤力太大，如果很轻易的就能激活可能无意中就会给机体造成重大伤害。而肿瘤细胞大多数情况下并不会给Ｔ细胞提供B7这个共刺激分子，因为它们并不傻，所以Eshhar的研究进展并不顺利，直到他给他的T-bodies装上共刺激分子受体之后情况才有所改观。所以，可以说以scFv-CDz为基础的第一代CAR-Ｔ基本上是失败的。 图六：激活T细胞需要两个信号
Eshhar只是一名科学家，不是一名临床医生，将CAR-Ｔ发扬光大的重任不应该由他来承担，但是，他确实对CAR-T的发展起到了至关重要的作用，CAR-Ｔ先驱的称呼他是当之无愧的！ Eshhar等人的研究成果出来后引起了广泛的关注，一时间江湖上风起云涌，各路人马都卯足了劲展开冲刺，要力争夺下CAR-Ｔ的头一把金交椅，而且，大家不约而同的都把目光从实体瘤转移到血液肿瘤，特别是B细胞白血病和淋巴瘤，因为让CAR-Ｔ细胞在实体瘤上发挥作用实在是太难了，而让Ｔ细胞去对付B细胞似乎较为容易。搞科研就像捏柿子，一定要先捡软的捏，这样出成果才快，有了成果才会有投资，有了投资才会有更多的成果，否则有可能一辈子默默无闻。而最终拔得CAR-Ｔ头筹并且名利双收的，是我们要介绍的第三位先驱人物，宾夕法尼亚大学的Carl H. June和他的团队。 图七：宾夕法尼亚大学的Carl H. June博士
Carl June在做实习医生的时候，曾经被分配去照看异基因骨髓移植后的患者，那个时候移植技术还很原始，他充分的感受到了Ｔ细胞诱导的排异反应对患者带来的巨大伤害和可怕后果。后来，他主要从事艾滋病的研究，因为HIV病毒主要感染Ｔ细胞，所以对于Ｔ细胞的研究非常深入，也取得了不少成果。2001年，他的夫人因为卵巢癌去世了，他开始转行搞癌症研究，一心一意的埋头苦干，终于在众多竞争对手中脱颖而出，拿出了有说服力的临床数据，他们做出来的针对B急淋的CTL-019以CD19为靶点，用4-1BB做共刺激结构域，属于第二代CAR-Ｔ，获得FDA批准后成为全世界第一个上市CAR-Ｔ产品，一时间Carl June几乎成了CAR-Ｔ代言人，这个成就应该足以让他告慰夫人的在天之灵了！ 图八：二代CAR-T产品CTL-019
当然，任何的成功其实都是努力和机遇的结合，Carl June的成功离不开另一位我们要介绍的CAR-Ｔ先驱人物，她就是那个名叫Emily Whitehead的小姑娘。2012年，Emily的急性白血病第二次复发，医生告诉她父母，前面已经没有路可走了，唯一的机会是参加临床试验。恰好，Carl June等人主持的针对儿童B急淋的CAR-Ｔ临床试验刚刚开始招募患者，之前他们治疗了几位成年患者，但效果一般，但Emily别无选择，成为了参加这项儿童急性白血病临床试验的第一位患者。细胞回输后没几天Emily就进了ICU，细胞因子风暴确实非常可怕，当时医生认为她只有大约1%的机会能挺过来，但是，在医生精心的照料下她成功的从ICU中出来了，三周后的检查未能在她体内发现哪怕是一个肿瘤细胞。更为重要的是，她之后没有做异基因干细胞移植，而现在已经是第五年了，她依然处于完全缓解中，根据为她提供治疗的费城儿童医院（CHOP）今年7月份的情况更新，她体内依然能够检测到CAR-Ｔ细胞，也就是说，可能有一小部分CAR-Ｔ细胞正如所愿的成为了中枢记忆性Ｔ细胞，对科学家们来说，这简直是美梦成真，因为CAR-Ｔ最理想的效果就是能够对肿瘤细胞起到一个长期的监视作用，好比打了一个专门的疫苗，有了抗体以后就终生不会再犯！ 图九：Emily Whitehead
我们在此也衷心的祝愿这位名字叫做“爱美丽.白头”的小姑娘能够快乐的白头到老！
毋庸置疑，Emily是至今为止CAR-Ｔ技术最成功的代表人物，是一位明星，但是，她却并不是第一位从CAR-Ｔ中获益的患者。第一位患者，应该是Steven Rosenberg于2010年在《血液》杂志上报告的一位滤泡性淋巴瘤患者，他先是接受了PACE方案的治疗，接着又参加了包括CTLA-4抑制剂在内的几个临床试验，效果都不好，最后，用了R-EPOCH方案，但也只是部分缓解，Rosenberg给他做了CAR-Ｔ治疗，靶点是CD19，共刺激分子选择的是CD28，属于二代技术，结果两次细胞回输后，原先的巨大肿块几乎完全消失了，虽然没有实现完全缓解，但是毕竟算是有史以来CAR-Ｔ治疗成功的第一个案例。奇怪的是，Rosenberg的报告并没有引起很大反响，也许是因为只是个例，后来人们几乎忘记了还有这么一位患者。直到2014年，Rosenberg在接受Onclive采访的时候，这位患者才再次被提起： 原来，这位患者的疾病五年后仍未出现进展，虽然对于滤泡性淋巴瘤来说不等同于治愈，但是也很了不起吧！所以，我认为Rosenberg的贡献是被under appreciated（低估了），也许他才配得上CAR-Ｔ第一人的称号。
（二）群雄逐鹿
将一项技术成果转化为商业产品，需要有足够的资源来提供各种保障，重磅抗癌药品尤为如此。所以，当以Carl June为首的宾大团队被诺华招安的时候，没有人觉得奇怪，因为这是顺理成章的事情。而诺华这个制药巨头成为全球第一个成功的摘到CAR-Ｔ果实的公司，即我们所要介绍的第一家拥有领先CAR-Ｔ技术的公司，也是对他们慧眼识珠的回报。特别是当Carl June遇到麻烦的时候，诺华慷慨解囊，成功的化解了危机。
事情的经过是这样的：各个科研小组之间，既是竞争对手，也存在合作关系，因为闭门造车是很难有所突破的。Carl June的团队也一直和其它医院的研究人员有合作，比如说，2003年宾大与St. Jude Children’s Research Hospital签署过一项Material Tranfer Agreement，根据这项协议，Carl June的团队可以与St. Jude的研究人员共享一些研究成果。当St.Jude的Dario Campana和Chihaya Imai两人搞出一个新的CAR-T细胞设计，用4-1BB做共刺激结构域，而不是CD28的时候，Carl June 要了一份copy，后来大获成功的CTL-019就是基于这个设计的，然而Carl June在他先后发表的三篇论文中有意无意的都没有提到St.Jude以及Dario Campana和Chihaya Imai的名字，于是，St. Jude非常不爽，特别是听说诺华开始与宾大展开商业合作的时候，立刻就向法院提起诉讼。财大气粗的诺华，一次性的支付了一千二百多万美元摆平了这件事情，并且答应在产品上市后按比例支付一定的专利费。St.Jude的专利，现在归属于一家叫做Juno Therapeutics的公司，这也是我们要介绍的第二家在CAR-Ｔ技术上领先的公司，这个专利，就是我们打算介绍的第一项关键专利，下面我们先说4-1BB是怎么回事。
前面说过，Ｔ细胞被激活需要有一个共刺激信号，而CD28就是最早被发现的共刺激分子受体，也是Ｔ细胞上最强的共刺激分子受体，刚发现时被称为clone 9.3，后来被WHO编号为CD28。CD28的刺激作用有多强呢？国外曾经有一家叫做TeGenro的公司做过一项临床试验，他们搞出一个CD28的superagonist（超激动剂），打算绕过MHC限制性的障碍直接激活Ｔ细胞，结果成功了，只不过是太成功了，六位年轻健康男性志愿者在注射了这个CD28超激动剂后90分钟内就发生了细胞因子风暴，12-24小时内就全部进了ICU，经全力抢救后虽然都活了下来，但是后来这个公司赔了很大一笔钱，这件事情成为临床试验历史上一次惨痛教训，打那以后再没有人敢轻易的去刺激CD28。
不过，老子在《道德经》里说过，“过刚者易折，善柔者不败”。CD28虽然强，但却不大能够持续，到了免疫应答后期，随着Ｔ细胞开始表达CTLA-4等抑制性受体，CD28的表达就被下调了，CD28-B7这条信号通路就不灵光了。所以，Ｔ细胞的持续活化还需要其它受体的帮忙，其中就包括4-1BB。4-1BB听上去好像怪怪的，其实它来源于对小鼠的gene mapping（基因定位），在小鼠身上编码这个受体的基因位于4号染色体，所以就有了这个编号，而在人身上对应的基因位于1号染色体。后来WHO统一编号的时候将其命名为CD137，可见其发现的时间远比CD28要晚。
4-1BB作为共刺激分子受体虽然不像CD28那么强，但是持续性（persistence）确实更好，在免疫应答后期当CD28已经衰竭的时候它仍然表达，也许是出于这个原因，St. Jude的研究人员将其选做第二代CAR-Ｔ细胞中提供第二信号的分子。总结一下，那就是第二代主流的CAR-Ｔ产品有两种设计，在共刺激结构域，一种用CD28，一种用4-1BB，如果你用4-1BB，就要向Juno买专利授权，got it？ 图十：二代CAR-T的两种主流设计
既然CD28强而不持久，CD137持久但不强，那么我们能不能把它们俩结合在一起，综合发挥其各自的优势呢？当然可以，第三代CAR-Ｔ就是这么设计的： 图十一： 三代CAR-T的设计
现在，已经有第四代CAR-T，就是在第三代的基础上再加点什么，比如说让CAR-Ｔ能够分泌白介素12，进一步强化免疫应答，或者装入一个自杀基因，当不良反应过强或者未来体内的CAR-Ｔ细胞成为麻烦的时候用药物让CAR-Ｔ细胞自我毁灭。由于第四代还没有公认的标准也没有已经成为主流的设计，下面就不再讨论了。而且，目前我们还不敢确信第三代或者第四代一定比第二代更好，所以，准备参加CAR-Ｔ试验的病友不要轻易的被忽悠，在做选择的时候不要把第几代当作很重要的考量标准，而更应该关注提供这个产品的生物公司的资质。如果同为二代产品，究竟哪种设计更好？目前，有不完全的证据表明，针对B急淋，4-1BB的设计比CD28的设计可能更好一些，CD28的设计细胞因子风暴更猛烈，而事后Ｔ细胞的衰竭更迅速，复发率较高；而针对非霍奇金淋巴瘤，两种设计目前难分高下。
以Juno的故事为例：虽然他们掌握了4-1BB的专利，但是他们也同时在开发CD28的产品，即针对B急淋的JCAR015，而且最早拿到了FDA的突破性疗法的资格认定，大家都以为Juno会先拔头筹，但没想到在试验过程中因为脑水肿死掉了三个，被FDA叫停试验。于是Juno赶紧出来道歉，并且说经过分析是因为在预处理方案中同时使用了环磷酰胺和氟达拉滨的缘故，下一步会取消氟达拉滨。但是，试验重新开始后又死了两个，还是脑水肿，FDA再也坐不住了，无限期叫停了这个试验，而 Juno也知道问题不在于氟达拉滨，而是整个产品设计都有问题，可能与CD28有关。最终的结果是，Juno彻底停掉了JCAR015这条产品线，等于说彻底放弃了CD28，专心致志的去赌4-1BB了，但是，考虑到前后耽误的时间、花费的金钱和失去的生命，代价可谓非常沉重，Juno不得不吞下苦果，眼睁睁的看着自己的竞争对手，也就是我们要介绍的第三家CAR-Ｔ技术领先的公司KitePharma继诺华之后拿到FDA的第二个上市批准。
Kite Pharma是由以色列出生的犹太裔美国人Arie Belldegrun于2009年创立的，他是一位泌尿肿瘤科医生。作为一家startup的小公司，Kite最初不特别引人注意。2012年，Kite与NCI签署了一系列合作协议，包括CAR-Ｔ的开发和商业化的协议。2013年，Kite公布了其针对弥漫大B细胞淋巴瘤的KTE-C19的初步成果，开始让人刮目相看。借助于资本市场对CAR-Ｔ概念的热炒，2014年Kite在纳斯达克上市，圈了大约一亿多美元。同年年底，Kite为KTE-C19向FDA提交了IND申请。今年8月，在FDA批准其产品上市前夕，吉利德宣布以119亿美元收购Kite Pharma。至此，Kite给所有人展现了一个极其完美的屌丝逆袭的故事，每一步都走对了，运气也特别好，从无人关注的nobody变成了人人仰视的somebody，为此，Kite要感谢一位贵人，那就是我们最初提到了以色列科学家Zelig Eshhar，从一开始，Kite就把他聘请为科学顾问，不仅在技术上提供指导，而且他的那项专利也为Kite的定价做出了极大的贡献，这就是我们要谈到的第二项关键专利，US Patent 7741465，美国媒体上将其称为Eshhar专利。
前面说过，第一代CAR-T几乎是Eshhar及其同事一手搞出来的，虽然因为没有共刺激分子因而效果不好，但它却是后面各代CAR-Ｔ的基础，特别是给Ｔ细胞装上scFv（单链抗体片段），这是具有originality的想法，后面的人谁也绕不过去。CAR-Ｔ就好比是一棵果树，现在已经接近成熟，所有人都在抢着摘果子，也包括我们中国的很多公司，没准儿我们说话的功夫就又有一家新公司成立了要去摘果子。但是，Eshhar专利就好比是树干，如果没有这个树干，连枝叶都不可能存在，何况果子。所以，想要摘果子需要先问问Eshhar同不同意哦。
当然，如果你有其它专利，是可以拿来交换的，比如说，Juno的发起人包括位于纽约的纪念斯隆凯特琳癌症中心（MSKCC），而MSKCC硬是把二代CAR-Ｔ里面的CD28共刺激分子这个设计给注册专利了，为此Kite几乎气晕，在法庭上和MSKCC打了一架，说CAR-Ｔ里面应该有一个共刺激结构是显而易见的，地球人都知道，不信你在大街上拉住一位大妈问一下她可能都知道。显然法官不同意这个说法，结果Kite的官司打输了。所以，现在那些正在抢着去摘果子的公司，一定得自己也有点技术积累和搞一点创新才成，否则人家会来上门收税的，毕竟树是人家栽的，凭什么让你免费摘果子。之所以还没来，是因为猪一定要养肥了再宰，否则哪里有肉？
（三）任重道远
好，到这里我们已经讲完了四个人物，三家公司和两项专利。接下去我们就要回答最关键的一个问题：CAR-T到底能不能成为克制癌症的“终极大法”？答案是: No! 目前我们距离全面的成功还有太远太远的距离。虽然以CD19为靶点的CAR-Ｔ疗法在B急淋和B细胞淋巴瘤上取得了很大的突破，但是，我们仍然不敢说CAR-T是这两种疾病的终极解决方案，因为还有太多太多的问题有待解决，下面一一道来。
让我们要从头说起。为什么做CAR-T选定CD19为靶点？前面说过，找到TAA即肿瘤特异性的抗原非常困难，即使找到，也不能保证所有肿瘤细胞都表达这个抗原。而对于B细胞来说，无论是正常的B细胞，还是变成白血病或淋巴瘤的B细胞，从祖B细胞开始，到浆细胞为止，几乎都稳定的表达CD19，可以说是一个非常稳定的抗原。另外，人是可以长期没有B细胞的，这种免疫缺陷可以用定期输丙种免疫球蛋白来弥补，所以，既然我们找不到B细胞白血病/淋巴瘤特异性的抗原，我们用好细胞坏细胞都表达的抗原来代替也行，宁可错杀一千，也不放过一个，这是B细胞白血病/淋巴瘤的优势，换成Ｔ细胞就不行了，我们一刻也离不开Ｔ细胞，这也是为什么到现在为止还没有针对T细胞的CAR-T的原因。 图十二：CD19在B细胞中的表达
那么，既然所有B细胞淋巴瘤表达CD19，为什么有人用CAR-Ｔ疗法完全无效？这也是让科研人员苦苦思索的问题。主要的原因如下：
1）肿瘤微环境。肿瘤细胞不会是坐以待毙的，通常它们会分泌一些抑制性的细胞因子，例如TGF-β和IL-10，其中TGF-β可以抑制T细胞增殖和降低其细胞毒性，并且促使T细胞向Treg细胞（调节性T细胞）的方向分化；IL-10会促使单核细胞分化为M2巨噬细胞，M2巨噬细胞表达PD-L1，对活化后表达PD-1的T细胞有抑制作用；另外，肿瘤细胞还会吸引很多Myeloid-derived Suppressor Cells（骨髓来源抑制性细胞，简称MDSC）到其周边。Treg细胞、M2巨噬细胞和MDSC会共同形成一个对T细胞极不友好的微环境，使CAR-T细胞很难充分发挥作用。目前，这个问题主要靠化疗预处理来解决，比如说CAR-T细胞回输前做低剂量环磷酰胺／氟达拉滨化疗，一方面是为了减轻肿瘤负荷，更重要的是减少体内Treg细胞的数量，为CAR-T细胞创造一个更适合的环境，这个环节非常重要，也亟待进一步优化。 图十三：抑制性肿瘤细胞微环境
2）CAR-Ｔ衰竭。在CAR-T治疗中，回输CAR-Ｔ细胞的数量是有讲究的，太多了不行，太少了也不行，我们期待发生的是CAR-Ｔ回输后会出现一个体内扩增的过程，说明它成功的识别了靶细胞并且充分的被激活了。但是由于一些个体原因，比如患者经多次化疗后Ｔ细胞质量很差，或者肿瘤微环境中抑制性细胞因子太多，CAR-Ｔ细胞不能充分的活化和扩增而且衰竭很快，就会使临床效果大打折扣。 图十四：CAR-T细胞回输后的数量变化
这是国外某临床试验中几位患者体内CAR-Ｔ细胞在回输后一年内的数量曲线，可以看出，01和02两位完全缓解的患者CAR-Ｔ细胞先是出现高水平的扩增，然后回落但持续处于较高的水平，而03和05两位部分缓解的患者CAR-Ｔ细胞数量衰竭的就比较快，至于对治疗无应答的06和07患者，几乎都没有出现体内扩增的现象，CAR-Ｔ短时间内就消耗殆尽，难怪没有效果。所以，现在探究的重点是如何让CAR-Ｔ细胞在体内持续的更久。
很多患者即使经CAR-T治疗完全缓解后还会复发，这个怎么破？这是让研究人员最头疼的问题。在没有很好的解决办法之前，某些情况下就只好把CAR-Ｔ仅当作通往移植的桥梁，而不是作为独立的治愈手段，只求CAR-Ｔ能够在最大程度上降低肿瘤负荷，为移植创造条件。显然，这不是一个让人非常满意的解决方案。所以，大家都在研究CAR-Ｔ后复发的问题，试图找到更好的办法。 图十五：基因突变和可变剪切产生不同的CD19蛋白产品
一部分人，复发后再次回输可能还有效，但是大约10%-20%的B急淋和个别的B细胞淋巴瘤，复发后肿瘤细胞全部变成了CD19阴性，不再对以CD19为靶点的CAR-T有应答。现在发现，这是由于两种原因造成的：1）编码CD19蛋白的基因2号外显子发生了突变，CD19蛋白丢失了能够让抗体识别的抗原表位；2）5号和6号外显子由于alternative splicing而被剪切掉了，作为一个跨膜蛋白，其位于细胞膜内的部分因此而丢失，使得整个蛋白从细胞上脱落，虽然抗原表位还在，但也没用了，因为CD19已经脱离了肿瘤细胞。有鉴于此，科研人员现在想出了双靶点的办法，除了CD19之外，还选择了CD22这个B细胞普遍表达的抗原作为另一个靶点，并且取得了初步的成功。当然，具体的技术还在优化中，到底是应该先CD19再CD22，还是CD19/CD22一起来，一起来的时候把CD19受体和CD22受体装在同一个细胞上还是分别装在不同细胞上，目前还没有答案。
总之，CAR-Ｔ技术还在发展之中，前途不可限量，但是目前还有太多的不确定因素。 至此，我们就完成了关于CAR-Ｔ的务虚部分，下篇我们着重于务实，帮助病友们了解如何从CAR-Ｔ疗法中获益。
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